Tenttiwiki

Differences

This shows you the differences between two versions of the page.

Link to this comparison view

immunonkemiallisen_koetekniikan_kurssi [2019/06/12 22:35] (current)
Line 1: Line 1:
 +====== Immunokemiallisen koetekniikan kurssi ======
 +
 +
 +==== 21.2.2005 ====
 +
 +1. Buffy coatista eristettiin PBMC-fraktio (veren mononukleaariset solut) Ficoll-gradienttisentrifugaatiolla. Tämän jälkeen solujen annettiin tarttua nylonvillapylvääseen ja pylvästä eluoitiin 10 ml:lla kasvatusmediumia. Osa soluista jatkopuhdistettiin MACS Pan T Cell Isolation Kit II:lla valmistajan ohjeen mukaan. Molemmille solupopulaatioille (ennen ja jälkeen MACS-puhdistuksen) suoritettiin suora kaksoisvärjäys (Fc-reseptorin blokkauksen jälkeen). Käytetyt vasta-aineet olivat anti-CD3-FITC ja anti-CD8-PE. Värjätyt solut analysoitiin virtaussytomtrillä. Tuloksia analysoitaessa saatiin (mm.) alla olevat dot plot -kuvaajat FL-1 vs. FL-2, joissa FL-1 on FITC-kanava ja FL-2 PE-kanava. Tulkitse analyysin tulos. Miten arvioit T-solujen puhdistumisen onnistuneen?​ Miten selität nelikentän UL-ruudun tapahtumat?
 +
 +{{facs.gif}}
 +
 +2. Jurkat E6-1 -solukloonin soluja aktivoitiin +37'​C:​ssa eri aikoja OKT-3 -vasta-aineella (anti-CD3) seuraavasti: ​
 +
 +|näyte 1 |ei OKT-3 |immunopresipitaatiokontrolli|
 +|näyte 2 |ei OKT-3 |aktivaatio 0'|
 +|näyte 3 |OKT-3, 2 min |aktivaatio 2'|
 +|näyte 4 |OKT-3, 5 min |aktivaatio 5'|
 +
 +Aktivoinnin jälkeen solut lyysattiin ja myös lysaatista otettiin näyte (näyte L). Näytteille 2-4 tehtiin tehtiin immunopresipitaatio käyttäen anti-PLC -vasta-ainetta (PLC = fosfolipaasi C-gamma, MP 160 000). Näyte 1 toimi IP-kontrollina jolle suoritettiin immunopresipitaatio ilman anti-PLC -vasta-ainetta. Kaikista näytteistä ajettiin SDS-PAGE ja proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvolle. Näytteet detektoitiin seuraavasti:​
 +
 +|Blotti A |näyte L |solulysaatti,​ anti-PLC -blottaus|
 +|       ​ |näyte 1 |anti-fosfotyrosiini -blottaus|
 +|        |näyte 2 |-"​-|
 +|       ​ |näyte 3 |-"​-|
 +|       ​ |näyte 4 |-"​-|
 +
 +|Blotti B |näyte 1 |anti-PLC -blottaus (samasta filtteristä P-Tyr vasta-aineen irrotuksen jälkeen| ​
 +|        |näyte 2 |-"​-|
 +|       ​ |näyte 3 |-"​-|
 +|       ​ |näyte 4 |-"​-|
 +
 +Tulkitse tulokset.
 +
 +{{blotti.gif}}
 +